因为一根“虎毛”，灭绝的老虎重现世间？没那么简单！

2024年3月，印尼科研人员通过分析来自爪哇岛的一根动物毛发，宣布已经灭绝数十年的爪哇虎可能仍有野生个体存活。该结果发表于国际学术期刊Oryx，引发了学界和公众的广泛关注。然而，在对该研究公布的“爪哇虎”DNA序列进行深入分析后，我们发现数据存在严重问题，无法支持爪哇虎仍然存在的结论。相关的分析和结果已于近日在Oryx在线发表。

虎（Panthera tigris）是世界上体型最大的猫科动物，曾广泛分布于亚洲大部分地区。然而，由于栖息地丧失、猎物锐减以及捕杀和偷猎等原因，野生虎的数量从20世纪初约10万只急剧下降至当前约4000只。

现代虎的9个亚种中，巴厘虎（P. t. balica）、里海虎（P. t. virgata）和爪哇虎（P. t. sondaica）分别于上世纪40、70和80年代灭绝，野外杳无踪迹的华南虎（P. t. amoyensis）现存约200只的圈养种群。野外仅存的5亚种——东北虎（P. t. altaica）、印支虎（P. t. corbetti）、马来虎（P. t. jacksoni）、苏门答腊虎（P. t. sumatrae）和孟加拉虎（P. t. tigris）——分布在支离破碎的栖息地中，濒临灭绝。如何有效保护野生虎，甚至在其历史分布区内实现重引入，已成为全球野生动物保护领域面临的重大挑战和远景目标。

虎的9个亚种，包括已灭绝的3亚种和现存的6亚种

（图片来源：Wildlife Friends Foundation，作者汉化）

虎的9个亚种及其历史和现存分布区

（图片来源：作者供图）

爪哇虎（见下图）是位于东南亚巽他群岛上3个岛屿特有的虎亚种之一，仅分布于爪哇岛。与东北虎、孟加拉虎等大陆亚种相比，爪哇虎体型较小，更接近苏门答腊虎和巴厘虎。历史上，爪哇虎曾广泛栖息于岛上森林和草原。随着当地人口增长、荷兰殖民者入侵，爪哇虎的栖息地遭到严重破坏，种群数量急剧下降。同时人兽冲突引发人为捕杀，进一步加剧了下降趋势。

到了1950年代中期，爪哇岛全岛仅剩25至50只野生虎。1972年，印尼政府在爪哇岛东南部设立保护区，但为时已晚。1979年，保护区内仅剩3只虎。自1980年代以来，尽管偶有目击传闻，但均未能证实。2008年，世界自然保护联盟（IUCN）正式宣布爪哇虎灭绝。

爪哇虎

（图片来源：wikipedia）

尽管爪哇虎灭绝已数十载，但是像许多“明星”物种一样，仍有人相信其神秘的存在，并孜孜不倦地寻找它的踪迹。自2008年以来，多次有报道称在爪哇岛发现老虎或其痕迹，不过因缺乏确凿证据，始终未能得到证实，直到五年前的一次目击传闻再次点燃人们的希望。

2019年8月18日，在爪哇岛西部South Sukabumi地区Cipendeuy村，当地一位动物爱好者Ripi Yanur Fajar称，他在村里种植园发现了一只疑似虎的动物，见到它一跃而出，消失在森林里。27日，研究人员Kalih Raksasewu来到现场勘查。他们发现了脚印和爪痕，还在道路与种植园之间的围栏上找到一根疑似虎毛的动物毛发（见下图）。“根据现场，我判断老虎跳出园子时，毛发可能会被围栏挂住”，Raksasewu告诉记者，“果然，我猜对了！”

Kalih Raksasewu等人在种植园围栏上采集的疑似虎毛的动物毛发

（图片来源：参考文献[1]）

和以往的目击报道不同，这次从现场采集到的毛发提供了可供检验的证据。研究人员可利用分子生物学技术对毛发进行DNA提取和分析，从而判断是否确实来自爪哇虎。

2024年3月21日，印尼研究者Wirdateti等人完成了对这根疑似“爪哇虎毛”的DNA分析，并将数据和结果发表于生态和保护生物学领域的国际学术期刊Oryx，宣告爪哇虎“重现”世间。

Wirdateti等人沿用常规的分子生物学技术流程，从疑似“虎毛”提取DNA，对线粒体的细胞色素b基因片段进行PCR（聚合酶链式反应）扩增，随后通过测序获得读长为1043碱基对的DNA序列。作者还从博物馆一份采集于1930年的“标准”爪哇虎标本的毛发中提取DNA并获得相应的测序数据。作者将实验获得的“疑似”和“标准”爪哇虎毛的两段DNA序列，和已经发表的虎和豹的DNA序列进行比对，以分析毛发的物种来源。

根据Wirdateti等人的分析，来自疑似“爪哇虎毛”的序列与来自苏门答腊虎、孟加拉虎、东北虎和爪哇豹的序列之间的遗传距离分别为0.074 ± 0.009、0.071 ± 0.009、0.072 ± 0.009和0.088 ± 0.010，而与他们从博物馆“标准”爪哇虎标本获得的DNA序列之间的遗传距离仅为0.040 ± 0.006。基于线粒体DNA序列构建的系统发生树中（见下图），疑似“爪哇虎毛”与博物馆“标准”爪哇虎聚为一枝，相对于其他样本，二者亲缘关系最近。

综合以上结论，难道2019年采集的这根“虎毛”真的来自爪哇虎？

修改自Wirdateti论文中的系统发生树，显示疑似“爪哇虎”线粒体DNA序列相对于其他虎亚种的位置存疑。数字表示该分支聚类的统计检验支持百分比程度。图中只展示了序列之间的拓扑结构，枝长没有实际意义。（图片来源：参考文献[2]）

Wirdateti等人题为“爪哇虎仍然存在？关于最近一根毛发的DNA分析”的文章一经发表，迅速引起了广泛的关注。根据学术研究影响力评价网站Altmetric，在文章发表的1个月后，该研究就已经被5个维基百科词条参考引用，并收获了来自全球83家媒体至少93份新闻稿的报道。这项研究的影响力评分已跻身Altmetric数据库中所有学术成果的前5%。

但问题总是隐藏在角落中。从表面上看，Wirdateti等人的论文似乎已经对疑似“虎毛”的物种来源做了详尽的论证，甚至通过了同行评议而发表于著名的国际学术期刊。然而，经过仔细的审阅和针对文章数据的重分析，我们对该结论提出了质疑。

我们课题组从事虎的遗传和演化研究20多年，奠定了虎亚种划分的分子遗传学基础[3]，也是马来虎亚种的发现和定名者[4]。Wirdateti等人在文章中引用了16条公开发表的虎线粒体DNA序列，就有11条来自我们的数据[4][5]。不过他们没有引用我们2023年最新发表的古代虎基因组数据[6]，其中已包括一份来源确凿的爪哇虎样本的线粒体基因组序列。

修改自本文作者团队2023年发表的基于不同虎亚种及古虎的线粒体基因组数据所构建的系统发生树，其中SON1和BAL1分别来自爪哇虎和巴厘虎的博物馆标本的DNA。

（图片来源：参考文献[6]）

修改自本文作者团队2015年发表的基于虎线粒体基因组中4078bp同源序列构建的单倍型统计网状图，其中包括了9只爪哇虎及2只巴厘虎。

（图片来源：参考文献[5]）

如以上两图所示，在2015年和2023年的研究中我们证明，爪哇虎与同样分布于巽他群岛的苏门答腊虎和巴厘虎亲缘关系最近，而与其他大陆虎各亚种之间的遗传距离较远。然而，在Wirdateti等人构建的线粒体DNA系统发生树中，不论是来自博物馆的“标准”爪哇虎，还是采集自种植园围栏的“爪哇虎毛”，都出乎意料地没有和苏门答腊虎聚为一枝，反而成为独立于所有虎的演化单系群的外群，与各虎亚种距离甚远。这显然与爪哇虎在现代虎中的演化地位是相悖的。

为了探究原因，我们下载了Wirdateti等人发表的这两段异常“爪哇虎”序列，并整合其他虎和其他豹属物种（美洲豹、雪豹、狮、豹）的线粒体DNA序列，重新进行序列比对和系统发生分析。

重构的系统发生树几乎重现了Wirdateti等人发表的异常现象（见下图）。为了能更直观地展示DNA序列之间的差异水平，我们保留了系统发生树的枝长信息。此时，上述提到Wirdateti等人报道的两条“爪哇虎”线粒体DNA序列的异常显得更加突兀：与豹属物种相比，来自不同虎亚种的标准序列紧密聚为一枝，且彼此之间的序列相似度非常高；然而，来自Wirdateti等人发表的两条“爪哇虎”序列则与其他所有虎线粒体DNA序列距离极远。

具体而言，已发表的确定虎线粒体DNA序列之间的平均遗传距离仅为5.645×10-3 ± 2.73×10-3，而疑似“爪哇虎毛”的序列与虎线粒体DNA序列之间的平均距离高达0.07353 ± 2.872×10-3，是前者的13倍以上，几乎达到不同物种之间的差异水平。这样显著的异常表明，Wirdateti等人发表的DNA序列并非来自虎的线粒体，更勿论爪哇虎。

修改自作者团队基于已有豹属线粒体序列及Wirdateti等人发表的异常序列重新构建的系统发生树，树中两条“爪哇虎”序列与其他虎线粒体DNA序列距离很远。数字表示该分支点的Bootstrap检验支持百分比。

（图片来源：参考文献[7]）

问题出在哪里呢？我们想到一个可能性：会不会是Numt作怪？

Numt（Nuclear mitochondrial DNA），即细胞核内线粒体DNA。它指的是细胞质中的线粒体DNA（Cytoplasmic mitochondrial DNA，简称Cymt）部分拷贝并转移到核基因组中所形成的假基因序列。这些转移到核基因组中的Numt通常不再具有基因功能，而是作为遗传信息的“化石”保存在核基因组中。尽管Cymt和Numt具有同源相似性，但它们在漫长的时间里独立演化，积累了相当的遗传差异。在PCR反应中，如果使用了非Cymt特异的引物，就可能导致Numt的非特异性扩增，给测序造成严重的干扰。豹属物种Numt干扰情况已经在此前被多次报道。在常用的公共数据库GenBank中，至今仍存在虎的Numt序列被错误标注为Cymt的情况。

修改自2006年对豹属物种Numt现象的研究，说明了豹属物种（豹、雪豹、狮、美洲豹、虎）核基因组普遍存在Numt，且与Cymt序列差异较大。

（图片来源：参考文献[8]）

为了验证这一假设，我们将Wirdateti等人报道的两段异常序列与虎的Cymt和Numt序列进行了相似性比较。正如我们所预料，这两段所谓“爪哇虎”的线粒体DNA序列都与虎核基因组F2染色体上的一段Numt序列具有很高的相似度（>97.4%），显著高于它们与虎Cymt序列的相似度（<92.5%）。这一结果表明，尽管Wirdateti等人旨在通过PCR获取样本中的Cymt片段，但遗憾的是，他们最终得到的序列却更像受到了来自Cymt的“远房亲戚”——Numt的干扰和污染。

读者可能会提出一个问题：即便不是虎的线粒体，是否仍然可以是虎的DNA呢？在我们文章投稿后，评审人也曾提出类似的疑问。对此，我们进行了更深入的探讨。

古DNA实验需在专用的无污染实验室中进行，并严格遵循规范化的操作流程。

（图片来源：北京大学罗述金实验室）

Wirdateti等人报道的这两段异常序列存在更多的疑点。疑似“爪哇虎毛”的DNA序列与他们博物馆采集的“标准”爪哇虎序列之间，平均每千碱基对竟存在多达24.7个变异位点。这一数值远高于两个虎基因组之间的差异。

作为参考，我们从爪哇虎、巴厘虎和苏门答腊虎等三种巽他群岛亚种15.5kb的线粒体基因组序列中，仅发现44个变异位点，相当于平均每千碱基对2.84个变异位点。虎核基因组的变异位点频率更低，不同亚种间每千碱基对仅相差0.26-0.72个位点。Wirdateti等人报道的两条所谓“爪哇虎”序列间的差异如此之大，表明即便是来自虎的核基因组区域，也不可能扩增自虎基因组中的同源区域。

在Wirdateti等人的研究中，疑似“爪哇虎毛”的样本仅有一根，另外一份来自博物馆的爪哇虎标本已有近百年历史。涉及古旧或痕量生物样本的研究，从样品处理、DNA提取到实验操作，每一个环节都必须严格规范，避免交叉污染，以确保研究结果的可靠性和准确性。这也是我们课题组分别于2015年[5]和2023年[6]从博物馆爪哇虎标本中获得线粒体部分序列以及线粒体基因组数据的操作规范。然而，由于Wirdateti等人没有提供数据质量控制的相关信息，我们无法确定究竟是什么原因导致了数据的异常。

总之，该研究存在着严重的数据质量问题。这些数据无法作为爪哇虎仍然存在的有效证据。序列来源尚且存疑，基于这些数据判断是否来自爪哇虎，更是无从谈起。

“在印尼，当你提到‘森林之王’，不言而喻，所有人都知道你说的是老虎。”Wirdateti如此向记者描述。而在中国及亚洲的许多地区，虎同样承载着“百兽之王”的象征意义，深植于传统和艺术之中，倍受尊崇。或许正是这种文化根源和情感，令公众对虎的消失感到深深的遗憾与失落，也使得一些人倾向于相信山林中仍有虎啸长吟。然而，现实往往难以与人们的美好期待相符。

2024年4月17日，在Wirdateti等人的论文发表于Oryx之后27天，我们联合从事虎的演化和保护工作多年、现今在马来西亚、丹麦、美国、德国、中国等国的同事，将对该研究的质疑、分析和论证整理成文，提交到Oryx编辑部。经过同行评审和修改，于12月6日在线发表。我们深入分析了原文存在的问题，提出了反驳的论证，明确指出爪哇虎此次“重现”没有可靠证据支持。

本文作者团队在线发表论文（图片来源：Oryx）

和所有人一样，我们初看到新闻时，也为曾宣告灭绝多年的爪哇虎可能复现感到惊喜和激动。然而，捍卫科学的原则是研究工作者的底线。唯有以严谨和客观为准绳，科学研究才能为濒危物种的保护提供可靠的依据，避免更多物种灭绝的悲剧上演。

作者：睢峥岩  罗述金

作者单位：北京大学生命科学学院